PARMS内含五引物体系，巧妙地将基因型与荧光激发光关联，可准确实现SNP、InDel位点的分型，精准区分纯合、杂合基因型。

体系组成

一管化试剂，内含两条通用荧光引物及反应必须的酶、dNTP、缓冲液。通用荧光引物带有荧光基团及淬灭基团，因荧光共振能量转移，荧光基团均处于淬灭状态，无荧光信号检出。

需自备目标位点特异引物及DNA模板。目标位点特异引物包括两条等位基因特异引物及一条反向公用引物，两条等位基因特异引物可分别与反向共用引物组合进行PCR扩增。

反应过程

• 等位基因特异引物结合于目标位点，与反向公用引物组合，进行扩增。PARMS基因分型试剂所含的自研DNA聚合酶，具有高度特异性，当且仅当等位基因特异引物3'末端完全匹配时才能延伸。

• 通用荧光引物识别接头序列，与反向公用引物组合，进行扩增。扩增时，淬灭基团与荧光基团分离，荧光共振能量转移被消除，荧光基团处于激发状态，可检出荧光信号。

结果输出

PCR反应结束后，仅需使用常规酶标仪采集荧光信号。

景肽生物自主研发在线工具SNPWay提供一站式数据分析，简单操作即可获得直观的基因分型图。

引物设计

需设计目标位点特异引物，包括两条等位基因特异引物、一条反向公用引物。

• 参考通用引物设计规则。引物长度18-30bp，扩增产物小于250bp。在满足设计条件前提下，扩增产物越短越好。

• 在两条等位基因特异引物5'端加上接头序列。

• 含有接头序列的等位基因特异引物，需重新评估其二级结构、二聚体情况。

景肽生物自主研发在线工具SNPWay可免费进行一键式引物设计。

引物筛选

推荐使用12~24个样本进行引物筛选，包括阴性对照2~3个，目标位点两种纯合子、一种杂合子各3~7个。

基因分型图中，阴性对照检出信号接近原点，两种纯合子检出信号靠近坐标轴，杂合子检出信号位于45°夹角区域，且各类信号聚类紧凑，则标记的分型效果较优。

景肽生物自主研发在线工具SNPWay可免费解析酶标仪荧光扫描文件,自动进行基因分型。

样本制备

DNA建议投入量为5-50ng/反应，投入量过低或者严重不均一可能导致分型失败。

PARMS内含景肽生物自主研发高效能聚合酶，有极高的灵敏度和特异性，可兼容CTAB、SDS、TPS、碱裂解等多种抽提方法。对于幼嫩样品可采取直扩PCR方式，样本处理仅需几分钟。

PCR反应

• PARMS PCR反应体系

• PARMS PCR反应程序

        *  每循环降低0.8℃

注意事项

• PARMS Mix需储存于-20℃，避免反复冻融。如有必要，请分装后冻存。

• 使用超纯水溶解引物、溶解或稀释样本。TE溶液中所含EDTA会影响体系Mg²⁺浓度，进而影响分型效果。

• 注意避免实验室气溶胶污染，制定严格的 PCR 前和 PCR 后的隔离措施。

• 需使用与荧光扫描设备相适配的PCR板、透光封膜，以确保荧光信号的准确收集。

Q1：为什么有的标记无法分型？

A1： 体系稳定后，无法分型的情形并不常见，可能原因及其解决方案如下：

        • 样本含有较多PCR抑制剂。请将模板进行梯度稀释再次尝试，或者进行纯化。

        • PCR循环过少，扩增仍处于指数增长期。请按94℃ 20sec、57℃ 1min的程序添加循环。

              需特别注意的是，盲目增加循环会导致假阳性，务必逐次添加。

        • 等位基因特异引物因3’末端降解导致失效。请重新合成引物。

        • PARMS Mix因储存不当失效。请将PARMS Mix储存于-20℃，避免反复冻融。